本发明属于基因工程技术领域,公开了一种载体、不依赖辅因子的5-HTP合成菌株、方法与应用,所述菌株为将基因T5H过表达质粒pHT01::T5H转入宿主菌,获得过表达T5H基因功能的工程菌。本发明基因工程菌株应用于5-HTP的生产,通过发酵法可以获得稳定的5-HTP。该基因工程菌株具有很好的工业化应用前景。本发明将过表达T5H基因的重组菌进行发酵分析,利用高效液相色谱法测定5-HTP的含量,产量为90mg/L。