本发明提供了一种L‑谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述L‑谷氨酸生产菌株通过基因敲除实现细胞壁和细胞膜的双转型控制，获得具有缺陷的谷氨酸棒杆菌，进而解决生物素亚适量菌株在发酵后期出现的菌体活力下降等问题，采用“双开关”发酵生产L‑谷氨酸，通过交替控制D‑谷氨酸和生物素两个转型“开关”，达到菌体快速转型和提高菌体发酵后期菌体活力的效果。