本发明提供了一种抗肿瘤活性肽物质及其制备方法和应用,所述抗肿瘤活性肽物质包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种。所述的抗肿瘤活性肽物质的制备方法,包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液热变性处理获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述变性豌豆蛋白水溶液获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述获得的豌豆蛋白酶解液,分别收集不同分子量组分；4)将所述收集到的组分中具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析,按峰收集各层析峰组分；5)将所述步骤4)中收集的层析峰组分经RP-HPLC进一步分离获得抗肿瘤活性肽物质。所述抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微。