本发明提供一种能够利用果糖合成甘露醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌K#12#MG1655的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行敲除,得到大肠杆菌突变体,并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因,构建重组载体,并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达,获得重组大肠杆菌,通过发酵技术诱导表达获得甘露醇。利用本发明方法构建的基因工程菌经发酵培养12h后,使用高效液相色谱进行检测,大肠杆菌具备生产甘露醇的能力,在常温下,甘露醇的产量可达30g/L#40g/L,有利于甘露醇的工业化生产。