本发明涉及一种制备胞二磷胆碱用酶制剂,制备步骤如下：构建工程菌Escherichia coli CKI-CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶；构建工程菌Escherichia coli PPK-UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶；构建工程菌Escherichia coli CMK-NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶；对发酵得到的产酶细胞进行破碎,离心收集上清液得到粗酶液。本发明首次报道了具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶可以用于胞二磷胆碱的合成,具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的异源可溶性表达量和酶活力更高。