本发明属于酶工程技术领域,具体涉及生成低聚半乳糖的乳糖酶及其制备和应用。本发明以两种来源的乳糖酶(来源于环状芽胞杆菌B2301的BglD305和来源于环状芽胞杆菌ATCC 31382的BglD)分子为基础进行分子进化,获得合成低聚半乳糖效率高、表达性能好的乳糖酶新酶分子；并构建乳糖酶高产菌株,能够在深层发酵时高效合成乳糖酶并将酶蛋白分子分泌到培养基中,从发酵上清中直接制备高活性的酶制剂,乳糖酶的表达水平可以达到2208U/mL,有助于降低乳糖酶的发酵制造成本、简化发酵制造工艺并提高乳糖酶酶制剂的质量。