本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种生产L-鸟氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主,不表达基因argF、argI、speC、speF；并且过表达基因argO、pntA、pntB；并将乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因argE替换为谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸乙酰基转移酶基因argJ并过表达；并且以生长期关联启动子P-(rpsL)控制α-酮戊二酸脱氢酶E1亚体编码基因sucA的表达；并且异源过表达谷氨酸棒状杆菌的精氨酸合成操纵基因argC、argJ、argB、argD。该菌株对L-鸟氨酸合成模块、辅因子供应模块和L-鸟氨酸转运模块进行了系统的优化；并在此基础上利用生长期关联启动子动态调控中心代谢途径中α-酮戊二酸代谢节点基因的表达强度,实现大肠杆菌中L-鸟氨酸的高效、稳定生产。