本发明提供了一种异亮氨酸途径人工操纵子与基因工程菌及其改造方法与应用,所述操纵子通过人工构建异亮氨酸合成途径将异亮氨酸途径相关基因进行整合,通过不同方式连接,优选了tac启动子以及RBS核糖结合位点序列,组合形成的人工操纵子具有稳定、高效、广泛适用性的优点,不同于以往较为粗放的异亮氨酸途径改造方式,该操纵子综合调控关键酶表达强度、提高辅因子供给、敲除竞争途径、加强外排蛋白,能够明显提高异亮氨酸的积累能力,当应用到L-异亮氨酸生产菌株时,发酵罐中L-异亮氨酸产量达到了58.6g/L,糖酸转化率34.7%,最高生产效率可达2.2g/L/h。