本发明提供一株生产缬氨酸的基因工程菌、构建方法及应用,属于基因工程技术领域,该工程菌的生产菌为大肠杆菌W3110,基因组上整合了乙酰乳酸合酶基因ilvK、乙酰羟基酸合酶基因ilvB和ilvN、酮醇酸还原异构酶基因ilvC、2,3-二羟基酸水解酶基因ilvD及亮氨酸脱氢酶基因bcd并使其强表达；敲除了苹果酸脱氢酶基因mdh、乳酸脱氢酶基因ldha、乙酸激酶基因ackA、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因ppsa、缬氨酸--丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因poxB、2-异丙基苹果酸合酶基因leuA、芳香族氨基酸氨基转移酶基因tyrB。该菌可高产缬氨酸,且杂酸积累量低,具有较高的工业生产价值。