本发明提出了一种用于检测D-阿洛酮糖的试剂盒及检测方法,涉及检测技术领域。该试剂盒包括：试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、试剂Ⅳ以及试剂Ⅴ。其中,试剂Ⅰ为磷酸盐缓冲液,试剂Ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),试剂Ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶,试剂Ⅳ的主要成分为D-阿洛酮糖。利用该试剂盒可在30分钟内完成96样本的检测,能够快速、准确地反映出样品中D-阿洛酮糖的浓度或含量。利用该试剂盒在检测过程中不受D-果糖及其他单糖等干扰物的影响,可应用于检测KEase酶促反应过程中D-果糖至D-阿洛酮糖的转化量以及筛选KEase酶变体。利用该试剂盒的检测过程中无需使用大型仪器设备,可显著降低检测成本。