本发明公开了一种高产β-烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株,构建步骤如下：过表达NAD～+合成酶基因NadE、烟酸磷酸核糖转移酶基因PncB和转运蛋白基因PnuC三种基因中的任意一个或两个或三个。本发明基因工程菌是以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌或酵母为底盘菌株,在底盘菌株中至少过表达NAD～+合成酶NadE、烟酸磷酸核糖基转移酶PncB与转运蛋白PnuC其中的一个基因获得的,从而实现微生物发酵高产β-烟酰胺单核苷酸。本发明无需使用ATP、烟酰胺等昂贵原料,经济效益显著。