本发明提供了一种尿苷生产菌株及其构建方法与应用,所述菌株利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术通过敲除E.coli Ora12基因组上rihA、rihB、rihC、udk、udp和ppnN基因,阻断了尿苷降解和UMP一步到尿嘧啶途径；敲除nupG基因、nupC基因,减少尿苷胞内运输；再通过敲除iclR基因,异源引入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168中核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs、乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因pyrF和乳清酸核糖基转移酶基因pyrE,过表达UMP磷酸水解酶基因umpH,弱化尿苷酸激酶基因pyrH,弱化尿苷酸激酶基因,所获得的菌株遗传稳定性好、发酵产率高,可稳定生产尿苷。