本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种生产N-乙酰氨基葡萄糖基因工程菌的构建及其应用。本发明以酿酒酵母为出发菌株,在基因组上整合N-乙酰氨基葡萄糖合成关键酶基因,得到一株产N-乙酰氨基葡萄糖的菌株。同时对N-乙酰氨基葡萄糖合成途径所需关键基因GFA1、GNA1、yqAB进行多拷贝强化,并敲除其前体物分支代谢途径基因PFK26、PFK27、PFK1,得到一株N-乙酰氨基葡萄糖合成能力显著提高的酿酒酵母菌株,具有重要的工业应用价值。