本发明涉及一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用,特别涉及基因工程领域。本发明提供了一种高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法,包括以下步骤：PCR扩增CYP5061基因左右同源臂,分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收,将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中,得到重组质粒；将重组质粒电转化至根癌农杆菌中,得到重组根癌农杆菌；将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养,得到重组黑曲霉。敲除本发明所述基因得到的菌株转化4-AD生成16β-OH-4AD特异性明显提高。