本发明公布了一种在酿酒酵母中高效无痕敲除的方法，并通过对该无痕基因敲除系统中的正向同源序列、半乳糖浓度及半乳糖诱导时间进行优化，第二步同源重组的概率达到6.86×10?4。

以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对野生酿酒酵母菌株基因BAT2高效的无痕敲除，通过白酒发酵实验，改造菌株的正丙醇、异丁醇和异戊醇含量亲本菌株相比分别降低了20.32％、47.85％和23.14％，达到了低产高级醇的目的。

该方法可广泛应用于酵母及其他微生物的基因改造，由于所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产，为直接在工业菌株中进行基因敲除提供了有益的参考。