本发明公开了一种利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因的穿梭质粒及其在集胞藻转化外源基因中的应用。该质粒利用集胞藻PCC6803的psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段作为同源重组上游臂,以psbA2基因ORF片段为同源重组下游臂基础上,在Kana抗性基因与终止子之间再插入Kana抗性基因启动子(Kana基因启始密码子ATG前174bp)以及目的基因获得穿梭质粒P5ST1T2KAN,利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因及在集胞藻中的表达。同时,本发明以上述穿梭质粒为载体,构建了以Kana基因启动子启动纤维素酶CelI15基因表达的集胞藻PCC6803工程藻株PSCE15,实现了利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和纤维素酶CelI15以及纤维素酶CelI15在集胞藻PCC6803中的异源表达。