本发明属于基因工程技术领域,公开了一种细胞培养用L-谷氨酰胺的生产方法和应用,包括如下步骤：敲除Escherichia coli BL21(ACCC11171)中的谷氨酰胺酶基因glsA和glsB；构建重组菌株质粒过表达谷氨酰胺合酶基因glnA和聚磷酸激酶基因ppk,谷氨酰胺合酶催化L-谷氨酸、ATP和铵盐形成L-谷氨酰胺,聚磷酸激酶催化ATP再生；培养重组菌株诱导产酶,配置酶反应体系催化L-谷氨酰胺的合成；分离纯化得到细胞培养级的L-谷氨酰胺。本发明中筛选的谷氨酰胺合酶可以高效催化L-谷氨酸向L-谷氨酰胺转化,L-谷氨酰胺的最高产量可达到590 mM(86 g/L),摩尔转化率为90%。