本发明提供一种负载益生菌的油包水乳液及其制备方法和应用,涉及益生菌产品领域。该负载益生菌的油包水乳液,其原料包括水相和油相,水相包括：益生菌悬液和凝胶基质,其中,凝胶基质是由两种凝胶原料分别配制成溶液、充分水合后进行混合、凝胶化处理得到的；油相包括：亲脂性乳化剂和油。本发明将具有双交联凝胶网络结构的凝胶基质作为益生菌悬液的载体,最终得到一种平均粒径较小、液滴大小均一、稳定性强的油包水乳液,能够延长益生菌在乳液中的储藏期及对于不利条件的抵抗能力,例如可增加乳液对于剪切力的抵抗能力,减少巴氏杀菌过程中对益生菌的损伤,减少胃肠消化过程对益生菌的损伤等。