本发明提供了谷氨酸棒杆菌CRISPR/Cpf1高效基因组编辑技术,先整合后诱导切割,将重组和切割事件分离,采用双质粒系统pEC-XK99E衍生质粒表达RecET和Cpf1置于感受态细胞中,兼容的pXMJ19质粒表达crRNA和提供供体DNA分子,提高了供体DNA模板的装载量,解决了谷氨酸棒杆菌大片段整合难题,同时整体提高了基因组编缉效率,为大片段基因组插入提供了可能,也为谷氨酸棒杆菌代谢工程研究和菌株构建提供了技术保障。