本发明提供了一种高效制备11α-羟基孕酮的重组雷斯青霉菌及其应用,属于基因工程和酶工程技术领域；本发明运用农杆菌介导转化的技术手段,将编码赭曲霉的甾体C11α-羟化酶突变体CYP68J5mL491F的基因定点整合取代雷斯青霉甾体C15α-羟化酶基因,获得的重组雷斯青霉菌能够高效转化甾体底物孕酮生成11α-羟基孕酮。突变体CYP68J5mL491F氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。底物孕酮的投料量为15g/L,转化72h,产物11α-羟基孕酮得率达到92％。本发明专利为研究开发高效C11α-羟化孕酮生产C11α-羟基孕酮工艺提供了宝贵的工业菌种和技术方法。