本发明提供了一种L-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用,通过构建辅酶平衡系统将L-缬氨酸合成与磷酸戊糖途径和TCA循环剥离开来,利用辅酶平衡以消除对除糖酵解和L-缬氨酸合成途径之外的代谢途径的依赖,且采用静态和动态代谢工程调控策略弱化回补途径和TCA循环,同时敲除了有机酸合成途径的关键基因,所构建菌株可以在好氧条件下高效率合成L-缬氨酸,发酵周期短,转化率高；不携带质粒,发酵过程无需控制微氧或厌氧,从而不产生有机酸等副产物,满足高纯度L-缬氨酸的生产要求,在氨基酸生产领域具有较为广泛的应用前景。