本发明涉及一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用,所述菌株在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因；整合了来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因、来源于伸长盐单胞菌Halomonas#elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因,均由强启动子PT7启动,重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因,由强启动子PT7启动；是目前报道的发酵法生产羟基四氢嘧啶的最高水平。