本发明公开了一种生产假尿苷的基因工程菌株,所述基因工程菌异源过表达嘧啶核苷操纵子,过表达假尿苷酸合成酶,过表达核糖激酶,过表达核糖核苷水解酶,过表达尿嘧啶渗透酶,不表达假尿苷转运蛋白和假尿苷激酶。本发明从大肠杆菌基因组水平出发,主要通过代谢工程技术手段,对尿苷酸合成途径、假尿苷合成途径、转运系统及假尿苷分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化,提高菌株的假尿苷发酵性能。本基因工程菌株的假尿苷产量高、生产性能稳定、能用于假尿苷生产。