本发明公开了一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法,所述方法以噬菌体繁殖相关基因为目的基因进行敲除,该方法在筛选基因缺失突变株时使用噬菌体排除野生型菌株的干扰,同时在含有抗生素的LB培养基验证抗生素敏感性,排除单交换子的干扰；所述方法在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后,仍能够筛选出基因缺失突变株。本发明提供了一种在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后,仍可以快速筛选出基因缺失突变株的方法。利用本发明方法得到的基因缺失突变株后,可以与野生型菌株做生物学特性实验进行比对,进一步研究宿主菌和噬菌体的相互作用分子机制。