本发明提供了生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用,所述基因工程菌为不含质粒、从头合成高产乳清酸的基因工程菌E.coli Ora,与现有的乳清酸生产菌相比,该基因工程菌具有遗传稳定性好、发酵产率高、糖酸转化率高等优势,所述基因工程菌以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成乳清酸,乳清酸产量可高达135.6g/L,具有很好的工业应用前景；该基因工程菌对大肠杆菌中嘧啶类核苷酸代谢网络中与乳清酸相关代谢流进行分析重构,加强了乳清酸合成和积累；之后引入野生型枯草芽孢杆菌嘧啶核苷操纵子中的二氢乳酸脱氢酶,进一步加强乳清酸合成,适合规模化工业生产的需要。