本发明公开了高效制备氢化可的松的蓝色犁头霉菌种及其构建方法,属于基因工程技术领域。发明利用CRISPR-Cas9编辑技术将来源于蓝色犁头霉的C11β-羟化酶CYP5311B2T329A突变体在缺失CYP5311B2的蓝色犁头霉菌株中高效表达,获得高效转化底物11-脱氧皮质甾醇制备氢化可的松的蓝色犁头霉重组菌株。底物11-脱氧皮质甾醇的总投料量为4g/L,通过转化72h,产物氢化可的松的得率达到85％。本发明为研究开发高效C11β-羟化11-脱氧皮质甾醇生产氢化可的松工艺提供了宝贵的工业菌种和技术方法。