本发明公开了一种无载体共固定苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的制备方法和应用,属于生物工程技术领域。本发明的具体方法包括以下内容：以聚乙二醇为沉淀剂、戊二醛为交联剂,通过无载体固定化-交联酶聚集体法,实现苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的固定化,之后利用固定化的苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生产L-苯丙氨酸、沙格列汀中间体、苯丙酮酸。此法制备得到的交联苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶聚集体的温度稳定性、pH耐受性和贮藏稳定性均有提高。本发明提高了酶法制备沙格列汀中间体的效率,降低了生产成本和分离纯化难度,适合大规模的连续化生产,对提高我国生产L-苯丙氨酸、沙格列汀中间体、苯丙酮酸的技术水平具有重大意义。