本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因编辑工具及其使用方法和应用,属于基因编辑技术领域。一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑工具,包括一个或多个重组质粒；所述重组质粒以pK18质粒为骨架载体,含有rpsLwt基因、筛选标志物基因、目的基因的左同源臂序列和右同源臂序列。本发明通过对pK18载体进行改造,成功构建了一个基于链霉素致死的氧化葡萄糖酸杆菌的双交换敲除系统pK18-P2798-KmR-PJ23104-rpsLwt-HA；应用此敲除系统,可以成功实现对特定基因的编辑；通过添加包含不同待编辑基因的重组质粒,还可以同时实现对多个目的基因的编辑,操作更简捷、更高效；本发明的敲除系统的敲除效率远高于传统敲除系统,传统的敲除效率只有40％左右,而本发明提供的敲除系统敲除效率可以达到70％左右。