本发明属于酶的基因工程技术领域,具体涉及一种磷脂酶D突变体及其制备与应用。所述磷脂酶D突变体是通过分子生物学技术手段将野生型磷脂酶D氨基酸序列的第346位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸获得的,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该磷脂酶D突变体相比于野生型磷脂酶D,催化活力显著提高。本发明获得的磷脂酶D突变体为合理设计磷脂酶D以提高其催化性能提供一定参考,可适用于生产各类天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物,应用于生物、食品、医药、日化等领域。