本发明提供了一株高产L-缬氨酸的基因工程菌,从大肠杆菌W3110出发,在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；并将大肠杆菌的支链氨基酸转氨酶基因ilvE替换为枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因bcd；并将大肠杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换为突变体L67E/R68F/K75E的编码基因。本发明还改进了L-缬氨酸发酵方法,采用双阶段溶氧控制,提高了L-缬氨酸产率和糖酸转化率。