本发明提供了一种尿嘧啶核苷酸生产菌株及其定向改造方法与应用,所述菌株利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术通过敲除ushA、nagD、surE、yjjG和ygdH基因,阻断了UMP到尿苷和尿嘧啶降解途径；敲除pykF基因以缩减碳代谢流向TCA循环,提高转化率；异源引入并过表达核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs、乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因pyrF和乳清酸核糖基转移酶基因pyrE；过表达磷酸ABC转运蛋白基因pstC-pstA-pstB,协同加强UMP合成代谢通路；最后,动态调控尿苷酸激酶基因pyrH,在不影响菌体生长的情况下,实现UMP快速积累；所获得的菌株不含质粒,无需诱导和缺陷物,且遗传稳定性好。